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AsCas12a (Cpf1) CRISPR酶
| 貨號 | 32104-01/32104-03 | 售價（元） | 1300/5500 |
| 規(guī)格 | 100 pmoL/1000 pmoL | CAS號 |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品信息
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
價格 |
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32104-01 |
AsCas12a (Cpf1) |
100 pmoL |
1300 |
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32104-03 |
AsCas12a (Cpf1) |
1,000 pmoL |
5500 |
產(chǎn)品簡介
AsCas12a(又名Cpf1)核酸酶來源于Acidaminococcus sp. BV3L6菌株。AsCas12a是由crRNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，在靶標(biāo)雙鏈 DNA 存在 PAM(TTTV，V=A/C/G)序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 AsCas12a 特異地剪切單鏈 DNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活 AsCas12a 的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng) AsCas12a酶與 crRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。因此，AsCas12a 酶不僅可用于體外 dsDNA 的特異剪切，也可用于靶標(biāo)核酸的快速檢測，詳見本公司開發(fā)的 HOLMES[1]核酸快檢技術(shù)。
產(chǎn)品組成
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組分 |
32104-01 (100 pmol) |
32104-03 (1,000 pmol) |
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AsCas12a Nuclease (10 μM) a |
100 pmol |
1,000 pmol |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
1 mL |
1 mL |
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Control Target DNA and crRNAb |
5 μL |
5 μL |
a. AsCas12a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target DNA and crRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。
保存條件
Control Target DNA and crRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmol
ssDNA 探針?biāo)璧?Cas12a 酶量定義為 1 transU[2]。
例：若某批次 AsCas12a 酶的反式剪切活性為 10.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 AsCas12a 酶可在 1 min 內(nèi)，在上述指定的反應(yīng)條件下，反式剪切 10 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU 數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1. 順式剪切實驗
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組分 |
體積 |
終濃度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM AsCas12a Nuclease |
0.5 μL |
250 nM |
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10 μM crRNA |
0.5 μL |
250 nM |
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1 μM Target DNAc |
0.5 μL |
25 nM |
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Nuclease-free Water |
Up to 20 μL |
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c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。 l若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標(biāo)，因為 ssDNA靶標(biāo)會被反式激活的 Cas12a 進一步切碎。對于 20 μL 順式 剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長度 target DNA需要 的 Cas 酶和 crRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計算，建議保持 Cas 酶:crRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 target DNA被剪切完全。
37℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。
2. 反式剪切實驗
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組分 |
體積 |
終濃度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM AsCas12a Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM crRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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1 μM Target DNAd |
0.5~5 μL |
25~250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free Water |
Up to 20 μL |
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d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪M行調(diào)整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，AsCas12a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告！
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結(jié)果
注意事項
1. 不同來源的 Cas12a 酶，其識別靶標(biāo)所需的 PAM 位點也略有不同，其中大部分 Cas12a 酶可識別 TTN 位點，而部分 Cas12a 則識別 TTTN 位點。
2. Cas12a 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a 在 crRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標(biāo) 需帶有 PAM 位點，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 位點。
3. Cas12a 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時，Cas12a/crRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合 物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時，Cas12a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 DNA 切碎。
4. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進行分子診斷實驗，可參考本公司的 HOLMES 體系[1]。
5. 驗為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
6. Cas12a 酶對熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
7. 如無特殊說明，本說明書的剪切反應(yīng)體系適用于本公司提供的所有類型的 Cas12a 酶。
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
參考文獻
[1]Li S, Cheng Q, Wang J, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discovery. 2018, 4: 20.
[2]Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics[J]. Frontiers in Microbiology. 2021, 12: 766464.